Фекалии для ПЦР
Забор материала
Используют пробы фекалий массой (объемом) 1-3 г (1-3 мл). Исследование мазков неинформативно из-за низкого содержания в них возбудителей.
Фекалии забирают из предварительно продезинфицированного горшка или подкладного судна. Пробу в количестве 1 грамма (примерно) отдельным наконечником с аэрозольным барьером или одноразовыми лопатками переносят в специальный стерильный флакон.
При исследовании нативных фекалий без предшествующего замораживания готовят фекальную суспензию (при водянистой консистенции фекалий в виде прозрачной жидкости фекальную суспензию не готовят).
Предобработка проб
Приготовление фекальной суспензии:
В соответствующее пробам количество микроцентрифужных пробирок (объемом 1,5 мл) вносят 0,8 мл фосфатного буфера (стерильного изотонического раствора натрия хлорида).
В каждую пробирку отдельным наконечником с аэрозольным барьером (или одноразовыми лопатками) вносят 0,1 г (0,1 мл) фекалий и тщательно ресуспендируют на вортексе до образования гомогенной суспензии.
При невозможности исследования материала в течение суток и/или необходимости длительного хранения к 10-20%-й суспензии фекалий в фосфатном буфере (или стерильном изотоническом растворе натрия хлорида) добавляют глицерин в конечной концентрации 10-15%. Подготовленные таким образом пробы замораживают только после тщательной гомогенизации и экспозиции с глицерином в течение 30-40 минут.
Приготовление бактериальной фракции фекалий для выявления бактериальных агентов:
Для приготовления бактериальной фракции фекалий используют фекалии водянистой консистенции, свежеприготовленную суспензию фекалий или суспензию, подвергавшуюся замораживанию с глицерином.
Пробирки с суспензией (водянистыми фекалиями) центрифугируют при 7-12 тыс. g (10-13 тыс об./мин. на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 5 минут.
Отдельным наконечником с аэрозольным барьером из каждой пробирки отбирают 0,05 мл бактериальной фракции фекалий (верхняя бело-желтая часть образовавшегося осадка). При отсутствии осадка или бело-желтого пограничного слоя между осадком и супернатантом отбирают 0,1 мл со дна пробирки или с границы осадка и супернатанта соответственно. Отобранную часть пробы, содержащую высокую концентрацию бактерий, переносят в новую пробирку, содержащую 0,8 мл фосфатного буфера (стерильного изотонического раствора натрия хлорида). Проводят тщательное ресуспендирование осадка на вортексе и центрифугирование при 7-12 тыс. g (10-13 тыс об./мин. на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 5 минут. Супернатант удаляют и осадок ресуспендируют на вортексе в 0,3 мл фосфатного буфера (стерильного изотонического раствора натрия хлорида).
Приготовление осветленного экстракта фекалий для выявления вирусных агентов:
Для приготовления осветленного экстракта фекалий используют фекалии водянистой консистенции, свежеприготовленную суспензию фекалий или суспензию, подвергавшуюся замораживанию с глицерином. Взвесь фекалий интенсивно гомогенизируют на вортексе. Осветляют полученную суспензию путем центрифугирования при 10 тыс. g (12 тыс об./мин. на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 5 минут.
Супернатант (0,1 мл) смешивают с отрицательным контрольным образцом (ОКО)(0,1 мл) в соотношении 1:1 и используют непосредственно для выделения РНК. При необходимости хранения супернатант отбирают в отдельную одноразовую пробирку.
Условия хранения материала и предварительно обработанных проб
Образцы нативных фекалий:
- при температуре 2-8°С — в течение 1 суток.
Фекальная суспензия с глицерином, бактериальная фракция и осветленный фекальный экстракт:
- при температуре минус 20°С — в течение 1 недели;
- при температуре минус 70°С — длительно.
Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.
Условия транспортирования материала и предварительно обработанных проб
Транспортирование клинического материала и предобработанных проб осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:
Образцы нативных фекалий:
- при температуре 2-8°С — в течение 6 часов.
Предобработанные пробы:
- в замороженном виде — в течение 1 суток.
Похожие статьи:
Примите к сведению
Информация на этом сайте представлена в справочных и образовательных целях и не должна быть использована как инструкция по лечению. В любых случаях необходимо консультироваться у врача.